斜纹夜蛾基因组研究揭示其食性和耐药性机制
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研究背景
斜纹夜蛾属鳞翅目夜蛾科害虫，因前翅具许多斑纹，中有一条灰白色宽阔的斜纹而得名。该害虫广泛危害亚洲热带和亚热带地区超过种农作物，给农作物产量带来10-30%的损失，是一种烈性害虫。另外，斜纹夜蛾对某些常用的农药制剂，比如Bt杀虫剂等产生高度抗性。夜蛾科物种目前尚未有参考基因组公布，通过对夜蛾科第一个测序物种夜蛾科斜纹夜蛾全基因组denovo测序，从基因组层面解析其进化、宿主特异性和适应性机理，为今后农药杀虫选择靶点提供参考。
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材料和方法
基因组测序，组装和注释：利用连续单胞配对24代的近交系（类似于植物中的自交系，目的是降低杂合度）中的雄性飞蛾为材料，构建插入片段为bp，bp，bp，bp，2Kb，5Kb和10Kb的文库，IlluminaHiseq测序。测序数据利用ALLPATHS-LG软件组装，Scaffold内部的Gap利用GapCloser填充。基因组组装完成之后，利用从头注释+同源基因注释+转录组数据三种方法对基因组进行注释，保证注释信息准确性。
2.1基因家族聚类和进化树构建
利用已经公布参考基因组的节肢动物门中物种（印度跳蚁，赤拟谷盗，二斑叶螨，意蜂等等）中编码超过30个氨基酸的基因进行基因家族聚类，挖掘同源基因，软件为Treefam。最终筛选出个单拷贝同源基因用于进化树的构建，利用物种间中性替代突变和化石标定综合计算物种的分化时间。
2.2连锁图谱构建
利用来自印度的雄性斜纹夜蛾和日本的雌性斜纹夜蛾杂交获得F1代，F1代中一头雄性和来自日本的雌性轮回亲本回交一次，构建共包含头的BC1代群体。利用RAD-seq简化基因组测序构建斜纹夜蛾高密度遗传连锁图谱。SNP的筛选原则如下：
A亲本中纯合但是具有多态性；
BF1中为杂合；
C符合孟德尔分离比；
DSNP位点的reads支持度为5，Q值大于20；
E2Kb范围内SNP的完整度≥91%。
利用JoinMap4.1软件构建遗传图谱。
2.3GR（gustatoryreceptor）、cytochromeP（CYP）、carboxylesterase(COE),glutathione-S-transferase(GST)、aminopeptidaseN(APN)和ATP-bindingcassette(ABC)基因家族注释
利用各自基因家族含有的特异性motif序列或者特异的氨基酸序列进行HMMER，Genewise进行BLASTN（BLASTP）比对筛选，结合GenBank等数据库注释。具体方法见原文。
2.4CYP、COE、GST、APN和ABC系统发育分析
鳞翅目基因组中每个基因家族的氨基酸序列进行Mafft（version7）比对，保守的区域留下进行下一步进化树构建，软件为MEGA（version6）。
2.5转录组测序
78个斜纹夜蛾不同组织，不同处理（siRNA+吡虫啉饲喂）样品的普通转录组，测序平台为IlluminaHiseq。
2.6群体遗传进化分析
利用15个来源于印度，中国，日本的斜纹夜蛾种群重测序，进行群体内多态性（π），群体间多态性Fst和基因流Nm分析种群多态性。利用QPQ模型解析群体结构。
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结果和分析
3.1组装、注释和常规比较基因组分析
通过全基因组鸟枪法测序和组装，最终组装出斜纹夜蛾.32Mb的参考基因组。包含了15,个编码基因和31.8%的重复序列。利用个RAD-tags遗传图谱将87%的序列挂在到31条染色体，包含.89Mb的基因组。通过与其他4个鳞翅目类物种比较基因组学分析发现斜纹夜蛾中含有最少的物种特异性基因家族。通过单拷贝直系同源基因构建系统发育树显示斜纹夜蛾在.7百万年前从家蚕和黑脉金斑蝶中分化出来，大约在百万年前从小菜蛾中分化出来。基因组共线性分析发现两次基因组融合事件，即斜纹夜蛾中6条染色体融合形成家蚕的3条染色体，另外6条染色体融合形成红带袖蝶的6条染色体，其他的8条融合形成红带袖蝶的4条染色体。
3.2基因家族收缩扩张
通过比较基因组分析发现斜纹夜蛾中味觉受体和解毒相关的基因家族（P，GST，COE，APN，ABC，CSP，OBP，OR，GR）急剧扩张，这可能和其食性有关。
3.2.1GR基因家族转录组和进化分析
转录组分析表明，至少个预测的GR基因在触须和成年蛾的鼻子上表达，也有大量GR基因在腿和信息素腺体上表达。
GR基因的急剧扩张和转录组组织特异性表达
3.2.2P基因家族扩张分析
在斜纹夜蛾基因组中注释到个P基因，其中P家族3和4出现明显的扩张，在染色体29上的CYP9a家族出现急剧扩张，转录组分析表明CYP9a亚家族表达受到花椒毒素，吡虫啉和蓖麻毒素的诱导。其他P家族基因也受到这些毒性物质的诱导，表明P家族中的亚家族扩张和斜纹夜蛾对毒性物质的耐受性相关，通过siRNA注射幼虫Knockdown分析+人工饲喂含有吡虫啉的食物试验也证明了这个相关性的猜测。
P和COE基因家族扩张和转录组验证
3.2.3GST基因家族扩张分析
来源于第9号第14条染色体的GST基因也能被毒性物质处理诱导表达。选择位于第14和第9号染色体的GST07和GST20家族作为代表分析其对毒性物质的响应。通过siRNA注射幼虫进行Knockdown分析+人工饲喂含有吡虫啉的食物试验证明GST家族的扩张能增强斜纹夜蛾的解毒能力。通过对COE等其他基因家族的研究也得到类似的结论。
GST基因家族扩张和转录组验证
3.3群体遗传进化分析
选择印度3个地区，中国11个地区和日本2个地区的斜纹夜蛾分析群体多态性。发现在印度海德拉巴，中国福建和日本冲绳地区的斜纹夜蛾非常高的遗传相似性（Fst＜0.01）。群体结构分析也支持这个结论。基因流分析表明印度迁移种-中国地方种、迁移种-日本迁移种存在广泛的基因交流，而印度迁移种和日本迁移种并无基因交流现象，说明中国是斜纹夜蛾在印度和日本基因交流的中心。这和前人的研究结果一致。即此外，影响基因流的另一个因素是台风可能跟会导致斜纹夜蛾从华南地区向日本迁移。年7月份亚洲地理气象数据可能支持这个结论。
斜纹夜蛾群体多态性和基因流分析
本研究组装了夜蛾科第一个参考基因组，与以往的比较基因组学泛泛而谈不同，该文从基因家族的角度深入解析了GR（gustatoryreceptor）、cytochromeP（CYP）、carboxylesterase(COE),glutathione-S-transferase(GST)等基因家族的扩张与斜纹夜蛾对杀虫剂难受性的关系，并进行了knockdown验证，同时提出了斜纹夜蛾长距离迁飞的一般模型（Nm分析）。为鳞翅目昆虫比较基因组学研究提供了数据和害虫防控的新方向，也为农业害虫的研究提供了全新的思路。另外，针对参考基因组而言，本文正文中并未提及组装质量（contigN50，scaffoldN50），如果利用三代+Hi-C的序列组装方案会得到一个更完美的基因组，为基因组的数据挖掘提供更准确和细致的数据资源。
参考文献
TCCheng,JQWu,YQWu,etal.GenomicadaptationtopolyphagyandinsecticidesinamajorEastAsiannoctuidpest.,NatureEcologyEvolution.
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